Полимеразная цепная реакция, также известная как ПЦР, является сложной диагностической технологией, способной обнаруживать инфекционные и вирусные заболевания. Подробнее о том, чем является ПЦР-диагностика, какими преимуществами она обладает и какие этапы проведения ее включает, мы расскажем в этой статье.

В частности, ПЦР-диагностика основывается на увеличении количества конкретной ДНК-части в образце, что позволяет ее определить в микроскопических количествах. Это обеспечивает высокую точность диагностики даже в случае незначительной концентрации заболевания.

Одним из главных преимуществ ПЦР-метода является его высокая чувствительность и специфичность, которые существенно повышают точность результатов тестов. Кроме того, ПЦР-диагностика может быть использована для обнаружения нескольких заболеваний одновременно, что экономит время и средства.

Этапы проведения ПЦР-диагностики включают подготовку образцов, извлечение и очистку ДНК, смешивание ДНК с реактивами, увеличение количества ДНК в циклах и анализ полученных результатов.

Таким образом, ПЦР-диагностика является перспективной и эффективной технологией, которая значительно облегчает задачу постановки диагнозов инфекционных и вирусных заболеваний. Ее преимущества и этапы проведения делают ее достойной конкурентом традиционных методов диагностики.

Описание ПЦР-диагностики: что это такое?

Сегодня ПЦР-диагностика, которая появилась более 30 лет назад, является одним из наиболее точных способов обнаружения инфекций. В такой диагностике используется метод, основанный на принципе многократного увеличения микроскопических концентраций фрагментов ДНК возбудителя в биологической пробе пациента в искусственных условиях. При этом производится амплификация, то есть простое увеличение числа копий молекулы ДНК, которая присутствует только у определенного вида патогенного микроорганизма, который интересует врача. Этот процесс происходит под воздействием ферментов и изменения температуры (от 50 до 95°С) и в результате сложного процесса образуется две молекулы ДНК из одной.

Цикл процесса образования новой молекулы ДНК занимает около 3 минут, и необходимое для достоверного визуального определения количество молекул получается после тридцати-сорока циклов.

С помощью ПЦР также можно производить различные манипуляции с генетическим материалом, такие как сращивание фрагментов ДНК, ввод мутаций и т.д. Использование ПЦР возможно не только для диагностики инфекционных и генетических заболеваний, но и для выделения новых генов и установления отцовства.

Эта диагностика проводится в специальных лабораториях, где используется амплификационное оборудование. Существует множество различных модификаций ПЦР, включая технологии, где используется не только ДНК, но и фрагменты рибонуклеиновой кислоты (РНК). Некоторые из этих модификаций не требуют специального оборудования, а амплификация осуществляется при постоянной температуре.

Одна из таких модификаций - «горячий старт ПЦР», которая подразумевает предварительное прогревание пробирок с амплификационной смесью при температуре 95°С в течение 3–5 минут, чтобы исключить клонирование неспецифических ДНК-фрагментов.

Одна из популярных модификаций ПЦР - мультиплексная амплификация (МПА), которая позволяет проводить исследования сразу нескольких изучаемых фрагментов в одной пробирке. Поэтому, она ускоряет и удешевляет анализ, при этом увеличивает точность исследования методом ПЦР.

Одним из наиболее востребованных методов анализа в клинической медицине является ПЦР-диагностика. Этот метод находит применение в самых различных сферах.

В области урогинекологии ПЦР-диагностика используется для выявления половых инфекций, характеризующихся слабой выраженностью симптомов и часто вызывающих бесплодие и невынашивание беременности у женщин. При помощи ПЦР можно выявить наличие целого «букета» инфекций, включая хламидиоз, несколько видов микоплазмы, уреаплазму, трихомониаз, гарднереллу, кандиду, гонококк и трепонему. Кроме этого, времянка и точность ПЦР-диагностики позволяют выявить генитальный герпес и вирус папилломы человека, предотвращая риск развития злокачественных заболеваний шейки матки у женщин.

В неонатологии ПЦР-диагностика эффективно выявляет наличие неонатальных инфекций у плода уже в утробе матери и у новорожденных. Среди опасных заболеваний отмечаются цитомегаловирус, токсоплазмоз, вирусы краснухи и герпеса, хламидии и микоплазмы.

Пациентам, инфицированным опасными заболеваниями крови или плазмы, такими как ВИЧ, сифилис, гепатиты, также требуется ПЦР-диагностика для избежания риска переливания крови. Метод ПЦР значительно превосходит по точности серологические методы, позволяя выявлять даже инфекции, имеющие длительный инкубационный период, которые не могут быть обнаружены обычными исследованиями в первые несколько недель.

В клинике инфекционных заболеваний ПЦР-диагностика применяется для выявления различных инфекций, включая вирусы гепатита, СПИД, холеры, бруцеллеза, туляремии, дифтерии и токсоплазмоза.

В фтизиатрии и пульмонологии ПЦР-диагностика является неоценимым инструментом для выявления возбудителей атипичных форм пневмонии и хронических рецидивирующих бронхитов, таких как хламидии и микоплазмы. Этот метод также позволяет проводить видовую идентификацию возбудителя и своевременно поставить диагноз туберкулеза.

Помимо клинической медицины, ПЦР-диагностика находит применение в криминалистике, экспериментальной медицине, создании генетических паспортов, мониторинге состояния окружающей среды, анализе продуктов питания, фармакологии и ветеринарии.

Оценить наличие возбудителя инфекции в организме иногда не так просто. Именно поэтому ПЦР-диагностика получила такое широкое распространение в медицинской практике. Она является более точным и надежным методом, чем многие другие аналитические способы, и имеет ряд явных преимуществ:

С помощью ПЦР-метода можно непосредственно определить наличие возбудителя инфекции. К примеру, иммуноферментный анализ (ИФА) выделяет только белки-маркеры, которые являются побочным продуктом жизнедеятельности микроорганизмов, и поэтому указывает на наличие инфекции косвенно. С другой стороны, ПЦР-анализ выявляет специфические участки в ДНК и с большой точностью указывает на присутствие конкретной инфекции.

Высокая специфичность ПЦР-диагностики обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляются лишь фрагменты ДНК, которые характерны только для определенных возбудителей инфекции. Это исключает вероятность ложных результатов анализа, чего неизбежно можно заблюдать в иммунологических методах, где ошибки возникают из-за перекрестной реакции антигенов.

ПЦР-диагностика также отличается от многих других методов высокой чувствительностью. Она позволяет выявить наличие даже единичных клеток вирусов или бактерий в таких случаях, когда обычными методами сделать это практически невозможно. Например, ПЦР позволяет выявлять всего 10-100 клеток в пробе, в то время как при использовании иммунологических и микроскопических тестов для определения инфекции необходимо иметь не менее 103-105 клеток.

Применение универсальных методов лабораторных исследований, которые диагностируют сразу несколько возбудителей из одной биологической пробы, является еще одним плюсом ПЦР-диагностики. Этот метод может применяться для выявления возбудителей инфекции не только в организме человека, но и в почве, воде, продуктах питания и других материалах.

Скорость получения результатов является еще одним преимуществом ПЦР-диагностики. Поскольку для проведения анализа не нужно производить посев и выделение культуры возбудителя, то и большого количества времени не требуется. Весь цикл от забора биоматериала до получения результатов занимает всего 4-5 часов.

В заключение, метод ПЦР-диагностики известен своей способностью диагностировать трудно культивируемые и некультивируемые формы микроорганизмов, которые могут вызывать скрытые инфекции.

Ограничения ПЦР-диагностики

Несмотря на то, что метод ПЦР-диагностики считается весьма эффективным, у него все же имеются ограничения. Однако их количество настолько мало, что это не может негативно сказаться на популярности и результативности данного метода.

Вероятность амплификации ДНК возбудителя может сохраняться даже после его гибели. При проведении теста для контроля эффективности лечения, необходимо учитывать определенные требования, в частности, проводить его через некоторое время после полного исчезновения возбудителя инфекции в организме – обычно это занимает от 1 до 2 месяцев.

Существует возможность возникновения перекрестной реакции. Праймеры – это фрагменты ДНК, подбираемые на основе знаний о генетической структуре конкретного возбудителя. Теоретически, такой же фрагмент может находиться в геноме других микроорганизмов, генетический код которых еще не расшифрован. Их наличие в тест-пробе может привести к неверному результату анализа.

Микроорганизмы могут изменяться, что может усложнить анализ при помощи ПЦР-диагностики. Иногда возникновение некоторых штаммов возбудителей может не выявляться в результате таких анализов.

В целях снижения рисков возникновения ошибочных результатов разработаны стандарты объемов испытаний тест-систем ПЦР-диагностики, включающие проверку на перекрестные реакции и тестирование всех известных штаммов конкретного возбудителя.

Метод ПЦР является прецизионной диагностической процедурой, проводимой на нескольких этапах в специализированной лаборатории.

Первый этап - забор биоматериала для исследования, который осуществляется в процедурном кабинете соответствующего профиля. Для диагностики используется эпителиальные соскобы со слизистых оболочек, моча, мокрота, кровь, плазма, сыворотка, биологические жидкости и биоптаты. Забор материала производится при помощи стерильного оборудования только в стерильные пробирки и с соблюдением всех рекомендаций.

Второй этап - хранение и транспортировка биоматериала. Допустимо хранение биоматериалов в течение двух недель при температуре -20°С, но оттаивание и повторное замораживание проб запрещено. Транспортировка, если необходима, должна проводиться в специальных термоконтейнерах или термосах.

Третий этап - выделение ДНК из образца. Метод выделения зависит от вида определяемого микроорганизма и от вида биологического образца.

Четвертый этап - проведение ПЦР. Пробирки с образцами переносятся в специальную микроцентрифужную пробирку, куда добавляется амплификационная смесь. Пробирки устанавливают в программируемый термостат, и автоматическим образом проводится амплификация.

Пятый этап - регистрация результатов. Фрагмент ДНК, характерный для возбудителя инфекции, выделяют методом электрофореза.

Шестой этап - интерпретация результатов исследования. Результат может быть либо положительным, либо отрицательным. Положительный результат говорит о том, что в организме человека обнаружены следы инфекции. На основании количественного результата можно сделать вывод о степени активности заболевания и определить характер лечения.

Стоимость ПЦР-диагностики: Что влияет на цену?

Цена на ПЦР-диагностику может очень сильно варьироваться и зависит от нескольких факторов. Как отмечается в статье, стоимость анализа зависит от конкретной инфекции, на которую пациент планирует проверяться, а также от вида анализируемого материала и методики тестирования - качественной или количественной. В разных медицинских клиниках цена за определение одной инфекции может варьироваться от 200 до 800 рублей.

Но это не все затраты, связанные с проведением ПЦР-диагностики. К стоимости анализа добавится оплата за забор биоматериала, которая составляет около 400 рублей. Примерные цены на анализы ПЦР в Москве приведены в таблице 1, где указаны цены на определение ДНК и РНК различных инфекций и вирусов.

Кроме того, многие медицинские центры предлагают провести ПЦР-исследование комплексно, включая несколько анализов в одном пакете услуг. Например, «ПЦР-8», который включает в себя восемь бактериальных и вирусных возбудителей острых кишечных инфекций, обойдется в 1400 рублей, а «ПЦР-12», включающий 12 половых инфекций, - в 3500 рублей. Комплексное проведение анализов позволяет существенно сэкономить деньги, поскольку отдельное прохождение ПЦР-диагностики для каждой инфекции будет гораздо дороже.

Фото: freepik.com